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本试剂盒采用DNA探针双染细胞核的方法检测细胞的状态。吖啶橙（Acridine Orange，AO）为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，红色荧光为AO-DNA(F>600nm)，绿色荧光为AO-RNA或单链DNA(F>530nm)。

在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

Propidium Iodide是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。

• 长期不用可以-20℃保存。
  
• 染色液避免反复冻融，多次冻融会导致失效。
  
• 染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 本试剂盒可用于细胞、细胞涂片等。以下以培养细胞的荧光显微镜检测为例，其他方法请参阅相关资料。
  
• 贴壁细胞可以消化下来染色，也可以直接原位染色。

• 染色工作液配制
  
  • 染色缓冲液的配制：
    根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL试剂C加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成染色缓冲液。
    
  • 每500μL染色缓冲液加入5μL AO染色液和10μL PI染色液，充分混匀，即成染色工作液。
    
    • 不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染色液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。
• 悬浮细胞染色
  
  • 收集样本细胞，细胞数量在10×10⁵个以内。
    
  • 用PBS洗涤细胞两次。
    
  • 用500μL染色工作液将细胞重悬。
    
  • 轻轻混匀后4℃避光孵育10～20分钟。
    
  • 用PBS洗涤细胞。
    
  • 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。
• 贴壁细胞原位染色
  
  • 用PBS洗涤细胞两次。
    
    • 注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。
  • 细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。
    
  • 37℃孵育细胞10～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
    
    • 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
  • 吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。
• 结果分析：
  在荧光显微镜下，选用488nm激发光镜检：
  
  • AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。
    
  • 当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。
    
  • 坏死细胞呈强红色荧光。